在組織培養(yǎng)過(guò)程中應(yīng)嚴(yán)格注意以下幾點(diǎn)無(wú)菌操作環(huán)節(jié)，才能?chē)?yán)格控制污染的發(fā)生。
一 組培材料的無(wú)菌化組織培養(yǎng)中外植體材料的初代培養(yǎng)無(wú)菌化體系的建立是組織培養(yǎng)工作順利進(jìn)行的關(guān)鍵，要獲得無(wú)菌培養(yǎng)材料，可采取以下幾個(gè)程序。
1．外植體材料的預(yù)培養(yǎng)。若選用植物的莖塵、莖段或葉片作外植體時(shí)，可于枝條未萌發(fā)或未抽枝前采回來(lái)進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)，即在污染較少的室內(nèi)或無(wú)菌條件下，將枝條用水沖洗后插入無(wú)糖營(yíng)養(yǎng)液中，使其發(fā)枝、抽芽以備用。
2．接種前表面殺菌消毒。外植體表面用5％的次氨酸鈉或0.1％～O.2％的升汞溶液處理，處理時(shí)間視植物種類(lèi)、外植體部位而定。對(duì)耐受力強(qiáng)的植物用升汞處理較好，lOmin內(nèi)即可有效殺死附著在植物體表的細(xì)菌，但要注意*除去升汞的殘留，需用無(wú)菌水沖洗至少5到7次或更多。用5％～1O％的次氯酸鈉處理時(shí)，不留殘毒，效果也好，是常用的表面殺菌劑。也可以對(duì)外植體材料在殺菌前進(jìn)行藥液浸泡，以加強(qiáng)滅菌效果。另外對(duì)于較為名貴的外植體材料一次很難清除污染的在培養(yǎng)lOd～20d中可用適宜的殺菌劑進(jìn)行二次處理。
3．培養(yǎng)基中添加抗生素及殺菌藥物。對(duì)材料內(nèi)部所帶的細(xì)菌和霉菌等雜質(zhì)，可以在培養(yǎng)基中添加不同濃度的抗生素或殺菌劑減輕或防止污染的出現(xiàn)。（如：青霉素、鏈毒素、甲基托布津、多菌靈等）。
二 器具、器材及培養(yǎng)基的滅菌定期清洗接種用具、培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿等，對(duì)于長(zhǎng)久未用的接種用具及培養(yǎng)瓶等要用強(qiáng)酸、強(qiáng)堿消毒，清潔劑擦洗，必要時(shí)進(jìn)行高溫滅菌。接種器械接種前必須進(jìn)行嚴(yán)格的高溫滅菌。及時(shí)定期檢查母液及未接種的空白培養(yǎng)基，看是否有污染發(fā)生。注意母液要存放與冰箱中以免出現(xiàn)芽孢桿菌污染。芽孢桿菌是一種耐熱力很強(qiáng)，高溫很難殺死的菌類(lèi)，一般存在于培養(yǎng)瓶壁和各種母液中，確保母液不被污染至關(guān)重要。培養(yǎng)基滅菌時(shí)一定注意不能堆放過(guò)滿(mǎn)，以免阻礙蒸汽流通和熱交換，造成物體內(nèi)部殺菌不*，另外，待鍋內(nèi)壓力升到0．5kg／cm2時(shí)打開(kāi)放氣閥，將鍋內(nèi)冷氣*排放干凈，然后再關(guān)閉放氣閥進(jìn)行滅菌，在穩(wěn)定壓力1．1kg／cm2，溫度120℃下持續(xù)滅菌15min～2Omin。培養(yǎng)瓶的棉塞要大小適中，瓶口要包扎嚴(yán)緊，防止病菌孢子從口而入。
三 無(wú)菌接種操作的技術(shù)環(huán)節(jié)保持無(wú)菌
1．確保接種室內(nèi)清潔無(wú)菌。定期用70％的酒精噴霧消毒，用消毒水擦試地面、工作臺(tái)等，定期用甲醛加少量錳酸鉀熏蒸進(jìn)行空間滅菌。每次接種前用紫光燈照射接種室、緩沖間及超凈臺(tái)20min，對(duì)紫光燈不能照到的死角要用流動(dòng)紫光燈進(jìn)行殺菌。關(guān)掉紫光燈后，應(yīng)提前開(kāi)啟超凈臺(tái)通風(fēng)機(jī)lOmin～l5min。另外要定期檢查，清洗超凈臺(tái)的濾布。
2．確保接種人員在接種前不帶菌。操作人員要勤梳洗勤剪指甲，接種前先用肥皂洗手，并用0．1％的新潔爾滅溶液洗手3min～5min，在緩沖間穿帶己消毒后的衣、帽、鞋并戴上口罩，方可進(jìn)入操作室。接種時(shí)避免說(shuō)話、咳嗽。
3．接種時(shí)要保持接種臺(tái)整潔。雙手用75％的酒精擦洗方可開(kāi)始接種工作，臺(tái)面放接種時(shí)*的器械，不要堆放過(guò)多物品，造成空氣不暢，使操作間得不到*凈化。
4．嚴(yán)把接種操作無(wú)污染關(guān)。初代接種時(shí)除嚴(yán)格按規(guī)程操作外，接種時(shí)培養(yǎng)基瓶口要轉(zhuǎn)動(dòng)在火焰上燒烤，繼代轉(zhuǎn)接時(shí)，對(duì)選用的擴(kuò)繁材料在進(jìn)接種室前，要用75％的酒精進(jìn)行外部消毒，打開(kāi)瓶口后應(yīng)傾斜向著火焰，動(dòng)作要輕，幅度應(yīng)適中，每次接種后器械需在95％的酒精中浸泡，然后在火焰上灼燒滅菌。接種期間要不斷用70％的酒精擦手及工作臺(tái)。
5．確保接種器械在接種過(guò)程中無(wú)菌。整個(gè)接種過(guò)程中要多次用75％的酒精擦洗滅菌，避免手觸碰培養(yǎng)物和器械伸入培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)的部分。
6．做好接種后清潔預(yù)消毒。每次接種完后應(yīng)*清潔接種室，并用0．5％的新潔爾滅溶液擦洗超凈臺(tái)及架擱等。
四 培養(yǎng)室內(nèi)污染的控制 培養(yǎng)室是培養(yǎng)物生長(zhǎng)的外部環(huán)境，除保持生長(zhǎng)物體適宜的光、溫、濕外，組培室的清潔、衛(wèi)生對(duì)于防止污染雜物生長(zhǎng)是不可忽視的問(wèn)題。因此對(duì)組培室要定期用75％的酒精噴霧降塵處理，并用0．5％的新潔爾滅溶液洗培養(yǎng)架、窗戶(hù)和地板。同時(shí)，及時(shí)清除組培室中的污染菌源和污染苗，并集中進(jìn)行高溫滅菌，另外，若進(jìn)行長(zhǎng)期大量培養(yǎng)，則有必要定期對(duì)培養(yǎng)室進(jìn)行熏蒸消毒，其甲醛與高錳酸鉀為2：1。
總而言之，控制或降低污染率是植物組織培養(yǎng)的關(guān)鍵技術(shù)之一，同時(shí)也是組織培養(yǎng)工作效率高低的重要指標(biāo)之一。從組織培養(yǎng)的全過(guò)程來(lái)看，每一環(huán)節(jié)都可能出現(xiàn)污染，為了實(shí)現(xiàn)低污染率在組織培養(yǎng)中除了加強(qiáng)無(wú)菌意識(shí)，提高無(wú)菌操作各環(huán)節(jié)的技術(shù)規(guī)程外，還要注重?zé)o菌操作訓(xùn)練，提高操作水平，同時(shí)在培養(yǎng)基中針對(duì)性的加入抑菌劑、抗菌素。
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