熒光染料的優(yōu)點: 產(chǎn)品僅用于科研使用簡便; 可以與任何PCR產(chǎn)物結(jié)合; 價格便宜; 熒光染料的缺點: 不能區(qū)分不同的雙鏈DNA 引物二聚體會影響檢測的敏感性 非特異性產(chǎn)物會影響結(jié)果的敏感性 引物二聚體和非特異性擴增問題可以通過熔解曲線 (Melting curve) 進行識別,進而通過PCR引物的設計和反應條件的優(yōu)化得以解決??偟膩碚f,SYBR Green I方法是一種基礎(chǔ)也的Real-time qPCR實驗手段。 特別提示:本公司的所有產(chǎn)品僅可用于科研實驗,嚴禁用于臨床醫(yī)療及其他非科研用途! 產(chǎn)品名稱 | 鴨源雞桿菌探針法熒光PCR檢測試劑盒 | 英文名稱 | Gallibacterium anatis | 貨號 | YSP96746 |
? 熒光探針: Real-e qPCR中的熒光探針為TaqMan探針,其基本原理是依據(jù)目的基因設計合成一個能夠與之特異性雜交的探針,該探針的5'端標記熒光基團,3'端標記淬滅基團。 正常情況下兩個基團的空間距離很近,熒光基因因淬滅而不能發(fā)出熒光。PCR擴增時,引物與該探針同時結(jié)合到模板上,探針的結(jié)合位置位于上下游引物之間。 當擴增延伸到探針結(jié)合的位置時,Taq酶利用5'外切酶活性,將探針5'端連接的熒光分子從探針上切割下來,從而使其發(fā)出熒光。檢測到的熒光分子數(shù)與PCR產(chǎn)物的數(shù)量成正比,因此,根據(jù)PCR反應體系中的熒光強度即可計算出初始DNA模板的數(shù)量。 TaqMan探針技術(shù)解決了熒光染料與非特異性擴增結(jié)合的問題,反應結(jié)束后無需通過熔解曲線檢測,縮短了實驗時間。 TaqMan探針技術(shù)的優(yōu)點: 熒光背景低; 敏感性高; 雜交穩(wěn)定性高; 熒光光譜分辨率好; 特異性高。 TaqMan探針技術(shù)的缺點: 成本高; 設計難度大; 只能用于檢測產(chǎn)物長度低于150bp的反應。 由于TaqMan探針的高特異性,可用于等位基因的辨別,特別適用于人類基因多態(tài)性以及根據(jù)SNP區(qū)別和定量菌株。 ? 熒光定量PCR原理: 產(chǎn)品僅用于科研熒光定量PCR早稱TaqMan PCR,后來也叫Real-Time PCR,是美國PE(Perkin Elmer)公司1995年研制出來的一種新的核酸定量技術(shù)。該技術(shù)是在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上加入熒光標記探針或相應的熒光染料來實現(xiàn)其定量功能的。其原理:隨著PCR反應的進行,PCR反應產(chǎn)物不斷累計,熒光信號強度也等比例增加。每經(jīng)過一個循環(huán),收集一個熒光強度信號,這樣我們就可以通過熒光強度變化監(jiān)測產(chǎn)物量的變化,從而得到一條熒光擴增曲線圖。 一般而言,熒光擴增曲線可以分成三個階段:熒光背景信號階段,熒光信號指數(shù)擴增階段和平臺期。在熒光背景信號階段,擴增的熒光信號被熒光背景信號所掩蓋,無法判斷產(chǎn)物量的變化。而在平臺期,擴增產(chǎn)物已不再呈指數(shù)級的增加,PCR 的終產(chǎn)物量與起始模板量之間沒有線性關(guān)系,根據(jù)終的 PCR 產(chǎn)物量也不能計算出起始 DNA 拷貝數(shù)。只有在熒光信號指數(shù)擴增階段, PCR產(chǎn)物量的對數(shù)值與起始模板量之間存在線性關(guān)系,我們可以選擇在這個階段進行定量分析。為了定量和比較的方便,在實時熒光定量 PCR 技術(shù)中引入了兩個非常重要的概念:熒光閾值和 CT值。 秦皮甲素2,二甲基-乙基吡咯 秦皮素(標準品)alpa-乙?;?gama-丁酯 秦皮乙素(標準品)雙(叔丁氧羰基) 秦皮乙素;6,7-二羥基;七葉亭2,4,6-三氟乙酮 茄尼氟-5-甲酸 (標準品)鬼臼毒素 3,5-二羥基乙酮 橙皮素三烷 青陽參苷元A(標準品)芐基三乙基溴化銨 青陽參苷元B(標準品)三氟磺酸鑭 東莨菪(標準品)三氟甲磺酸釤 東莨菪發(fā)光氨 頭孢美唑鈉;唑甲氧頭孢菌素2-基-4,二乙氧基丁酸乙酯 4'-去甲氧基表鬼臼毒素(標準品)甲甲酸甲酯 去甲氧基姜黃素(標準品)溴-2-氯吡啶 去甲異波爾定(標準品)2,6-二氯-氟吡啶 去氫二異丁香酚(標準品)3,二甲氧基-環(huán)-1,2-二酮 去氫鉤藤(標準品)2-降莰烷甲 鴨源雞桿菌探針法熒光PCR檢測試劑盒抑癌基因ras同源家族1抗體Cecropin/FITC 熒光素標記抗菌肽/天蠶素抗體IgG100 ul 轉(zhuǎn)錄激活蛋白2α/TFAP2α/AP-2α抗體CENPA /FITC 熒光素標記兔抗、大、著絲粒蛋白A抗體IgG100 ul 心鈉素抗體Phospho-CENP-A (Ser7)/FITC 熒光素標記兔抗、大、著絲粒蛋白A抗體IgG20 ul 氨酰tRNA合成酶2抗體Phospho-HER3(Tyr1197) /FITC 熒光素標記酸化HER3受體抗體IgG100 ul 絲氨酸抑制蛋白激酶C底物抗體Phospho-HER3 (Tyr1222) /FITC 熒光素標記酸化HER3受體抗體IgG100 ul 核突觸蛋白α抗體Phospho-HER4 (Tyr1284) /FITC 熒光素標記酸化HER4抗體IgG100 ul 自噬相關(guān)蛋白4B抗體C-erbB-4/HER4/erbB-4 /FITC 熒光素標記c-erbB-4癌基因抗體IgG100 ul 整合素樣金屬蛋白酶與凝血酶1型-12抗體Phospho-HER4 (Tyr984) /FITC 熒光素標記酸化HER4抗體IgG100 ul α-輔肌動蛋白4(內(nèi)參)抗體c-fos/FITC 熒光素標記即刻早期基因(原癌基因)抗體IgG100 ul PCR技術(shù)的定量原理: 擴增曲線 在Real- qPCR中,對整個PCR反應擴增過程進行了實時的檢測并記錄其熒光信號,隨著反應的進行,監(jiān)測到的熒光信號可以繪制成一條曲線,即為擴增曲線。熒光擴增曲線一般分為基線期、指數(shù)增長期和平臺期。 在Real-time qPCR擴增早期,擴增的熒光信號被熒光背景信號所掩蓋,無法判斷產(chǎn)物量的變化,此時即為基線期。 PCR反應過程中產(chǎn)生的DNA拷貝數(shù)是呈指數(shù)形式增加的,隨著反應循環(huán)數(shù)的增加,終PCR反應不再以指數(shù)形式生成模板,從而進入“平臺期”。在該時期,擴增產(chǎn)物已不再呈指數(shù)級的增加,PCR的終產(chǎn)物量與起始模板量之間無線性關(guān)系,所以根據(jù)終的PCR產(chǎn)物量不能計算出初始模板量。 |