PCR技術(shù)的定量原理: 擴增曲線 在Real- qPCR中,對整個PCR反應(yīng)擴增過程進行了實時的檢測并記錄其熒光信號,隨著反應(yīng)的進行,監(jiān)測到的熒光信號可以繪制成一條曲線,即為擴增曲線。熒光擴增曲線一般分為基線期、指數(shù)增長期和平臺期。 在Real-time qPCR擴增早期,擴增的熒光信號被熒光背景信號所掩蓋,無法判斷產(chǎn)物量的變化,此時即為基線期。 PCR反應(yīng)過程中產(chǎn)生的DNA拷貝數(shù)是呈指數(shù)形式增加的,隨著反應(yīng)循環(huán)數(shù)的增加,終PCR反應(yīng)不再以指數(shù)形式生成模板,從而進入“平臺期”。在該時期,擴增產(chǎn)物已不再呈指數(shù)級的增加,PCR的終產(chǎn)物量與起始模板量之間無線性關(guān)系,所以根據(jù)終的PCR產(chǎn)物量不能計算出初始模板量。 熒光染料的優(yōu)點: 產(chǎn)品僅用于科研使用簡便; 可以與任何PCR產(chǎn)物結(jié)合; 價格便宜; 熒光染料的缺點: 不能區(qū)分不同的雙鏈DNA 引物二聚體會影響檢測的敏感性 非特異性產(chǎn)物會影響結(jié)果的敏感性 引物二聚體和非特異性擴增問題可以通過熔解曲線 (Melting curve) 進行識別,進而通過PCR引物的設(shè)計和反應(yīng)條件的優(yōu)化得以解決??偟膩碚f,SYBR Green I方法是一種基礎(chǔ)也的Real-time qPCR實驗手段。 產(chǎn)品名稱 | 牛肺線蟲探針法熒光PCR檢測試劑盒 | 英文名稱 | Dictyocaulus viviparus | 貨號 | YSP96625 |
? 熒光探針: Real-e qPCR中的熒光探針為TaqMan探針,其基本原理是依據(jù)目的基因設(shè)計合成一個能夠與之特異性雜交的探針,該探針的5'端標記熒光基團,3'端標記淬滅基團。 正常情況下兩個基團的空間距離很近,熒光基因因淬滅而不能發(fā)出熒光。PCR擴增時,引物與該探針同時結(jié)合到模板上,探針的結(jié)合位置位于上下游引物之間。 當擴增延伸到探針結(jié)合的位置時,Taq酶利用5'外切酶活性,將探針5'端連接的熒光分子從探針上切割下來,從而使其發(fā)出熒光。檢測到的熒光分子數(shù)與PCR產(chǎn)物的數(shù)量成正比,因此,根據(jù)PCR反應(yīng)體系中的熒光強度即可計算出初始DNA模板的數(shù)量。 TaqMan探針技術(shù)解決了熒光染料與非特異性擴增結(jié)合的問題,反應(yīng)結(jié)束后無需通過熔解曲線檢測,縮短了實驗時間。 TaqMan探針技術(shù)的優(yōu)點: 熒光背景低; 敏感性高; 雜交穩(wěn)定性高; 熒光光譜分辨率好; 特異性高。 TaqMan探針技術(shù)的缺點: 成本高; 設(shè)計難度大; 只能用于檢測產(chǎn)物長度低于150bp的反應(yīng)。 由于TaqMan探針的高特異性,可用于等位基因的辨別,特別適用于人類基因多態(tài)性以及根據(jù)SNP區(qū)別和定量菌株。 ? 熒光定量PCR原理: 產(chǎn)品僅用于科研熒光定量PCR早稱TaqMan PCR,后來也叫Real-Time PCR,是美國PE(Perkin Elmer)公司1995年研制出來的一種新的核酸定量技術(shù)。該技術(shù)是在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上加入熒光標記探針或相應(yīng)的熒光染料來實現(xiàn)其定量功能的。其原理:隨著PCR反應(yīng)的進行,PCR反應(yīng)產(chǎn)物不斷累計,熒光信號強度也等比例增加。每經(jīng)過一個循環(huán),收集一個熒光強度信號,這樣我們就可以通過熒光強度變化監(jiān)測產(chǎn)物量的變化,從而得到一條熒光擴增曲線圖。 一般而言,熒光擴增曲線可以分成三個階段:熒光背景信號階段,熒光信號指數(shù)擴增階段和平臺期。在熒光背景信號階段,擴增的熒光信號被熒光背景信號所掩蓋,無法判斷產(chǎn)物量的變化。而在平臺期,擴增產(chǎn)物已不再呈指數(shù)級的增加,PCR 的終產(chǎn)物量與起始模板量之間沒有線性關(guān)系,根據(jù)終的 PCR 產(chǎn)物量也不能計算出起始 DNA 拷貝數(shù)。只有在熒光信號指數(shù)擴增階段, PCR產(chǎn)物量的對數(shù)值與起始模板量之間存在線性關(guān)系,我們可以選擇在這個階段進行定量分析。為了定量和比較的方便,在實時熒光定量 PCR 技術(shù)中引入了兩個非常重要的概念:熒光閾值和 CT值。 特別提示:本公司的所有產(chǎn)品僅可用于科研實驗,嚴禁用于臨床醫(yī)療及其他非科研用途! 左旋肉;維生素BT;左卡尼汀Histone H3 (96C10) Mouse mAb(氟甲酰)酸 左卡尼汀;左旋肉(標準品)PRC1 Antibody氯-氟 L-谷氨酸鈉,一水Synaptophysin (D8F6H) XP® Rabbit mAb2,二氟 L-谷氨酰(標準品)Synaptophysin (D8F6H) XP® Rabbit mAb氟-1,2-二 谷胱甘肽(還原型)Notch Isoform Antibody Sampler Kit1,1,1-三氟-2,戊二酮 L-谷胱甘肽(標準品)Helios (D4Z6D) Rabbit mAb2-溴-5-硝基三氟甲 谷胱甘肽(氧化型)Phospho-Histone H3 (Ser10) (D2C8) XP® Rabbit mAb (Biotinylad)利巴韋林 L-高絲氨酸;(S)-2-氨基-羥基丁酸BLNK (D3P2H) XP® Rabbit mAb羥基吡咯并[2,d]嘧啶 DL-異亮氨酸BLNK (D3P2H) XP® Rabbit mAb溴三 L-賴氨酸鹽酸鹽SATB1 (P472) Antibody葛根素 L-鳥氨酸鹽酸鹽T2 (D6C7K) Rabbit mAb (Mouse Specific)2,4,6-三(2-吡啶基)三 L-天門冬氨酸CDC73 (A264) Antibody三乙基氧翁四氟酸 L-天門冬氨酸(標準品)CDC73 (D410) Antibody2-三氟甲基吡啶 L-半胱酸鹽酸鹽無水物SATB1 (L745) Antibody羥基-6-(三氟甲基)嘧啶-2-硫 L-精氨酸對硝基酰cdc25A Antibody2-硝基咪唑 羧甲司坦;S-羧甲基-L-半胱氨酸Akt (pan) (40D4) Mouse mAb (Sepharose® Bead Conjuga)三氟肼 S-芐基-L-半胱氨酸GFAP (GA5) Mouse mAb (Alexa Fluor® 488 Conjuga)(三氟甲基)肼 L-谷氨酸鹽酸鹽GFAP (GA5) Mouse mAb (Alexa Fluor® 555 Conjuga)3',4'-二氟乙酮 牛肺線蟲探針法熒光PCR檢測試劑盒肥胖抑制素ELISA試劑盒phospho-Smad2(Ser465) 酸化Smad2抗體20 ul 肥大細胞類胰凝蛋白酶ELISA試劑盒Smad4 Smad4抗體100 ul 肥大細胞類胰蛋白酶(MCT)ELISA試劑盒Smad7 Smad 7抗體20 ul 防御素5 ELISA試劑盒phosphor-SMAD2 (Ser425) 酸化細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子SMAD2抗體100 ul 芳烴受體核轉(zhuǎn)位因子樣蛋白1(ARNTL)ELISA試劑盒Phospho-Smad2 (Ser465/467) 酸化細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子SMAD2抗體100 ul 泛素連接酶(E3/UBPL)ELISA試劑盒Phospho-Smad2 (Ser245/250/255) 酸化細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子SMAD2抗體100 ul 泛素結(jié)合酶UBC5 ELISA試劑盒Smad3 細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子SMAD3抗體100 ul 泛素結(jié)合酶(E2/UBCE)ELISA試劑盒Phospho-Smad3 (Ser423/425) 酸化細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子SMAD3抗體100 ul 泛素激活酶(E1/UBAE)ELISA試劑盒SMC1 染色體結(jié)構(gòu)維持蛋白質(zhì)1抗體100 ul |