PCR技術(shù)的定量原理: 擴增曲線 在Real- qPCR中,對整個PCR反應擴增過程進行了實時的檢測并記錄其熒光信號,隨著反應的進行,監(jiān)測到的熒光信號可以繪制成一條曲線,即為擴增曲線。熒光擴增曲線一般分為基線期、指數(shù)增長期和平臺期。 在Real-time qPCR擴增早期,擴增的熒光信號被熒光背景信號所掩蓋,無法判斷產(chǎn)物量的變化,此時即為基線期。 PCR反應過程中產(chǎn)生的DNA拷貝數(shù)是呈指數(shù)形式增加的,隨著反應循環(huán)數(shù)的增加,終PCR反應不再以指數(shù)形式生成模板,從而進入“平臺期”。在該時期,擴增產(chǎn)物已不再呈指數(shù)級的增加,PCR的終產(chǎn)物量與起始模板量之間無線性關(guān)系,所以根據(jù)終的PCR產(chǎn)物量不能計算出初始模板量。 熒光染料的優(yōu)點: 產(chǎn)品僅用于科研使用簡便; 可以與任何PCR產(chǎn)物結(jié)合; 價格便宜; 熒光染料的缺點: 不能區(qū)分不同的雙鏈DNA 引物二聚體會影響檢測的敏感性 非特異性產(chǎn)物會影響結(jié)果的敏感性 引物二聚體和非特異性擴增問題可以通過熔解曲線 (Melting curve) 進行識別,進而通過PCR引物的設計和反應條件的優(yōu)化得以解決??偟膩碚f,SYBR Green I方法是一種基礎也的Real-time qPCR實驗手段。 產(chǎn)品名稱 | 敗血梭狀芽胞桿菌探針法熒光PCR檢測試劑盒 | 英文名稱 | Clostridium septicum | 貨號 | YSP96566 |
? 熒光探針: Real-e qPCR中的熒光探針為TaqMan探針,其基本原理是依據(jù)目的基因設計合成一個能夠與之特異性雜交的探針,該探針的5'端標記熒光基團,3'端標記淬滅基團。 正常情況下兩個基團的空間距離很近,熒光基因因淬滅而不能發(fā)出熒光。PCR擴增時,引物與該探針同時結(jié)合到模板上,探針的結(jié)合位置位于上下游引物之間。 當擴增延伸到探針結(jié)合的位置時,Taq酶利用5'外切酶活性,將探針5'端連接的熒光分子從探針上切割下來,從而使其發(fā)出熒光。檢測到的熒光分子數(shù)與PCR產(chǎn)物的數(shù)量成正比,因此,根據(jù)PCR反應體系中的熒光強度即可計算出初始DNA模板的數(shù)量。 TaqMan探針技術(shù)解決了熒光染料與非特異性擴增結(jié)合的問題,反應結(jié)束后無需通過熔解曲線檢測,縮短了實驗時間。 TaqMan探針技術(shù)的優(yōu)點: 熒光背景低; 敏感性高; 雜交穩(wěn)定性高; 熒光光譜分辨率好; 特異性高。 TaqMan探針技術(shù)的缺點: 成本高; 設計難度大; 只能用于檢測產(chǎn)物長度低于150bp的反應。 由于TaqMan探針的高特異性,可用于等位基因的辨別,特別適用于人類基因多態(tài)性以及根據(jù)SNP區(qū)別和定量菌株。 ? 熒光定量PCR原理: 產(chǎn)品僅用于科研熒光定量PCR早稱TaqMan PCR,后來也叫Real-Time PCR,是美國PE(Perkin Elmer)公司1995年研制出來的一種新的核酸定量技術(shù)。該技術(shù)是在常規(guī)PCR基礎上加入熒光標記探針或相應的熒光染料來實現(xiàn)其定量功能的。其原理:隨著PCR反應的進行,PCR反應產(chǎn)物不斷累計,熒光信號強度也等比例增加。每經(jīng)過一個循環(huán),收集一個熒光強度信號,這樣我們就可以通過熒光強度變化監(jiān)測產(chǎn)物量的變化,從而得到一條熒光擴增曲線圖。 一般而言,熒光擴增曲線可以分成三個階段:熒光背景信號階段,熒光信號指數(shù)擴增階段和平臺期。在熒光背景信號階段,擴增的熒光信號被熒光背景信號所掩蓋,無法判斷產(chǎn)物量的變化。而在平臺期,擴增產(chǎn)物已不再呈指數(shù)級的增加,PCR 的終產(chǎn)物量與起始模板量之間沒有線性關(guān)系,根據(jù)終的 PCR 產(chǎn)物量也不能計算出起始 DNA 拷貝數(shù)。只有在熒光信號指數(shù)擴增階段, PCR產(chǎn)物量的對數(shù)值與起始模板量之間存在線性關(guān)系,我們可以選擇在這個階段進行定量分析。為了定量和比較的方便,在實時熒光定量 PCR 技術(shù)中引入了兩個非常重要的概念:熒光閾值和 CT值。 特別提示:本公司的所有產(chǎn)品僅可用于科研實驗,嚴禁用于臨床醫(yī)療及其他非科研用途! 二氯(分析標準品,用于環(huán)境分析,≥99.99%(GC))Phospho-Ezh2 (Thr311) Antibody式碳酸鋅 1,二氧六環(huán)(分析標準品,≥99.9%(GC))Oct-4 (V241) Antibody泰妙菌素 氯-1,2-標準溶液(1000μg/g,基體:乙酸乙酯)Adiponectin (C45B10) Rabbit mAb(+)-灰黃霉素 環(huán)己(分析標準品,≥99.7% (GC))Adiponectin (C45B10) Rabbit mAb3,乙二氧噻吩 9,10-二甲基蒽(標準品)XBP-1s (E8C2Z) Mouse mAb鋁鎳合金 3,5-二酚(標準品)ATR Antibody環(huán)基酸頻哪酯 二環(huán)己(分析標準品,>99.5%(GC))Phospho-Tyrosine Hydroxylase (Ser40) Antibody乙炔 二并噻吩(標準品)Tyrosine Hydroxylase Antibody基酸 9,10-二基蒽(標準品)AMPKα (F6) Mouse mAb二茂鐵甲酸 反式-1,2-二氯乙(標準品)SCD1 (C12H5) Rabbit mAb葉黃素 3,二氨(標準品)AMPKα1 AntibodyD-2,二氨基丁酸 2,二氯酚(標準品)AMPKα1 Antibody氯 T 2,5-二氯酚(標準品)Lyn (C13F9) Rabbit mAb沃來西脫藍B 3,二氯酚(標準品)Lyn (C13F9) Rabbit mAb溴-2-氟吡啶 3,5-二氯酚(標準品)ERp72 Antibody甲硫基酸 對二甲酸二甲酯(標準品)Claspin Antibody甲氧基-氟甲 鄰二甲酸二異酯(標準品)PRSS15/LONP1 (D8W1J) Rabbit mAbBOC-D-4,4'-二基 硫(分析標準品,>99%(GC))Survivin (6E4) Mouse mAb三氟酸 敗血梭狀芽胞桿菌探針法熒光PCR檢測試劑盒犬α1微球蛋白(α1-MG)ELISA試劑盒NR2D/NMDAR2D 谷氨酸受體2D抗體200 ul 犬α-1/2干擾素(IFN-α1/2)ELISA試劑盒N-Ras 原癌基因抗體100 ul 犬S100鈣結(jié)合蛋白A12/鈣粒蛋白C(S100A12)ELISA試劑盒NR1D1/REV-ERB alpha 細胞核受體Rev-Erbα抗體100 ul 犬S100B蛋白(S100B)ELISA試劑盒Phospho-REV-ERB alpha (Ser55/59) 酸化細胞核受體Rev-Erbα抗體100 ul 犬P選擇素(SELP)ELISA試劑盒Nrf2 核因子2相關(guān)因子2抗體100 ul 犬P物質(zhì)受體(TACR1)ELISA試劑盒phospho-Nrf2 (Ser40) 酸化核因子2相關(guān)因子2(Ser40)抗體100 ul 犬N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(NAG)ELISA試劑盒NRF-1 核呼吸因子-1抗體100 ul 犬N端前心鈉肽(NT-ProANP)ELISA試劑盒CD303/BDCA-2 C型凝集素結(jié)構(gòu)域家族4成員C抗體100 ul 犬N端前腦鈉素(NT-proBNP)ELISA試劑盒CD304/Neuropilin-1 神經(jīng)纖毛蛋白-1抗體100 ul |