PCR技術(shù)的定量原理: 擴增曲線 在Real- qPCR中,對整個PCR反應擴增過程進行了實時的檢測并記錄其熒光信號,隨著反應的進行,監(jiān)測到的熒光信號可以繪制成一條曲線,即為擴增曲線。熒光擴增曲線一般分為基線期、指數(shù)增長期和平臺期。 在Real-time qPCR擴增早期,擴增的熒光信號被熒光背景信號所掩蓋,無法判斷產(chǎn)物量的變化,此時即為基線期。 PCR反應過程中產(chǎn)生的DNA拷貝數(shù)是呈指數(shù)形式增加的,隨著反應循環(huán)數(shù)的增加,終PCR反應不再以指數(shù)形式生成模板,從而進入“平臺期”。在該時期,擴增產(chǎn)物已不再呈指數(shù)級的增加,PCR的終產(chǎn)物量與起始模板量之間無線性關(guān)系,所以根據(jù)終的PCR產(chǎn)物量不能計算出初始模板量。 熒光染料的優(yōu)點: 產(chǎn)品僅用于科研使用簡便; 可以與任何PCR產(chǎn)物結(jié)合; 價格便宜; 熒光染料的缺點: 不能區(qū)分不同的雙鏈DNA 引物二聚體會影響檢測的敏感性 非特異性產(chǎn)物會影響結(jié)果的敏感性 引物二聚體和非特異性擴增問題可以通過熔解曲線 (Melting curve) 進行識別,進而通過PCR引物的設(shè)計和反應條件的優(yōu)化得以解決。總的來說,SYBR Green I方法是一種基礎(chǔ)也的Real-time qPCR實驗手段。 產(chǎn)品名稱 | 結(jié)腸彎曲桿菌探針法熒光PCR檢測試劑盒 | 英文名稱 | Campylobacter colic | 貨號 | YSP96492 |
? 熒光探針: Real-e qPCR中的熒光探針為TaqMan探針,其基本原理是依據(jù)目的基因設(shè)計合成一個能夠與之特異性雜交的探針,該探針的5'端標記熒光基團,3'端標記淬滅基團。 正常情況下兩個基團的空間距離很近,熒光基因因淬滅而不能發(fā)出熒光。PCR擴增時,引物與該探針同時結(jié)合到模板上,探針的結(jié)合位置位于上下游引物之間。 當擴增延伸到探針結(jié)合的位置時,Taq酶利用5'外切酶活性,將探針5'端連接的熒光分子從探針上切割下來,從而使其發(fā)出熒光。檢測到的熒光分子數(shù)與PCR產(chǎn)物的數(shù)量成正比,因此,根據(jù)PCR反應體系中的熒光強度即可計算出初始DNA模板的數(shù)量。 TaqMan探針技術(shù)解決了熒光染料與非特異性擴增結(jié)合的問題,反應結(jié)束后無需通過熔解曲線檢測,縮短了實驗時間。 TaqMan探針技術(shù)的優(yōu)點: 熒光背景低; 敏感性高; 雜交穩(wěn)定性高; 熒光光譜分辨率好; 特異性高。 TaqMan探針技術(shù)的缺點: 成本高; 設(shè)計難度大; 只能用于檢測產(chǎn)物長度低于150bp的反應。 由于TaqMan探針的高特異性,可用于等位基因的辨別,特別適用于人類基因多態(tài)性以及根據(jù)SNP區(qū)別和定量菌株。 ? 熒光定量PCR原理: 產(chǎn)品僅用于科研熒光定量PCR早稱TaqMan PCR,后來也叫Real-Time PCR,是美國PE(Perkin Elmer)公司1995年研制出來的一種新的核酸定量技術(shù)。該技術(shù)是在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上加入熒光標記探針或相應的熒光染料來實現(xiàn)其定量功能的。其原理:隨著PCR反應的進行,PCR反應產(chǎn)物不斷累計,熒光信號強度也等比例增加。每經(jīng)過一個循環(huán),收集一個熒光強度信號,這樣我們就可以通過熒光強度變化監(jiān)測產(chǎn)物量的變化,從而得到一條熒光擴增曲線圖。 一般而言,熒光擴增曲線可以分成三個階段:熒光背景信號階段,熒光信號指數(shù)擴增階段和平臺期。在熒光背景信號階段,擴增的熒光信號被熒光背景信號所掩蓋,無法判斷產(chǎn)物量的變化。而在平臺期,擴增產(chǎn)物已不再呈指數(shù)級的增加,PCR 的終產(chǎn)物量與起始模板量之間沒有線性關(guān)系,根據(jù)終的 PCR 產(chǎn)物量也不能計算出起始 DNA 拷貝數(shù)。只有在熒光信號指數(shù)擴增階段, PCR產(chǎn)物量的對數(shù)值與起始模板量之間存在線性關(guān)系,我們可以選擇在這個階段進行定量分析。為了定量和比較的方便,在實時熒光定量 PCR 技術(shù)中引入了兩個非常重要的概念:熒光閾值和 CT值。 特別提示:本公司的所有產(chǎn)品僅可用于科研實驗,嚴禁用于臨床醫(yī)療及其他非科研用途! 氯化溶液(3.3mol/L(3.3N))Phospho-Beclin-1 (Ser93) (D9A5G) Rabbit mAb氯-6-甲基嘧啶 氯化溶液(3mol/L(3N))CYP1A2 (D2V7S) Mouse mAb萘亞 重鉻酸(分析標準品,99.998%)LC3C (D1R8V) Rabbit mAb甲基酸氧雜環(huán)丁烷酯 重鉻酸標準溶液(0.1mol/L)Phospho-FoxO3a (Ser7) Antibody氯-3,5-二氟 重鉻酸標準溶液(1/24mol/L(0.25N))YAP (D8H1X) XP® Rabbit mAb (Alexa Fluor® 488 Conjuga)5-(氯磺酰基)-2-氟甲酸 重鉻酸標準溶液(1/60mol/L(0.1N))β2-microglobulin (D8P1H) Rabbit mAb (PE Conjuga)2,5,6-三氨基-羥基嘧啶硫酸鹽 硫酸標準溶液(0.1000mol/L(0.1N))Rb (4H1) Mouse mAb (PE Conjuga)1,2-雙(*基硅氧基)乙烷 硫酸標準溶液(100g/L)Phospho-CD79A (Tyr182) (D1B9) Rabbit mAb三羥甲基烷三縮水甘油 高錳酸標準溶液(1/5KMnO4:0.1mol/L)Phospho-S6 Ribosomal Proin (Ser235/236) (D57.2.2E) XP® Rabbit mAb (APC Conjuga)-9基咔唑 高錳酸標準溶液(0.02000mol/L(0.1N))PTP-PEST (D4W7W) Rabbit mAb[(芐氧基)基]酸 高錳酸標準溶液(0.1000mol/L(0.5N))LC3C (D3O6P) Rabbit mAb二鹽基性硬脂酸鉛 化溶液(100g/L)RTF1 (D7V3W) Rabbit mAb溴-三氟 化溶液(1/60mol/L(0.1N))Mitofusin-1 (D6E2S) Rabbit mAb氯-2- 玫紅酸(AR)Phospho-SLP-76 (Ser376) (D9D6E) Rabbit mAb2-溴吡啶-甲 玫紅酸(指示劑級)Phospho-SLP-76 (Ser376) (D9D6E) Rabbit mAb5-羥基喹喔啉 氫氧化鈉標準溶液(1.000mol/L(1N))SignalStain® Citra Unmasking Solution (10X)2-基吩噻 氫氧化鈉標準溶液(0.5000mol/L(0.5N))SignalStain® Citra Unmasking Solution (10X)2-氯-6-氨基并噻唑 氫氧化鈉標準溶液(0.2000mol/L(0.2N))SignalStain® EDTA Unmasking Solution (10X)雙草酸氧化鈦(IV)酸二水合物 結(jié)腸彎曲桿菌探針法熒光PCR檢測試劑盒大內(nèi)皮素(Big ET-1)ELISA試劑盒IFABP 小腸型脂肪酸結(jié)合蛋白抗體100 ul 大腸癌專一抗原4(CCSA-4)ELISA試劑盒IFABP 小腸型脂肪酸結(jié)合蛋白抗體100 ul 大腸癌專一抗原3(CCSA-3)ELISA試劑盒IFI16/p16 γ干擾素誘導蛋白16抗體10 mg 大腸癌專一抗原2(CCSA-2)ELISA試劑盒IFITM1/CD225 干擾素誘導跨膜蛋白1抗體10 mg 存活素抗體/生存蛋白(Surv)ELISA試劑盒IFN-Beta 干擾素-β抗體(抗)1 ml 脆性組氨酸三聯(lián)體(FHIT)ELISA試劑盒IFN-Alpha 干擾素-α抗體(抗)1 ml 催素誘導蛋白(PIP)ELISA試劑盒IFN-Alpha 2b 干擾素α2b抗體100 ul 催素抑制激素(PIH)ELISA試劑盒IFN-Beta 干擾素-β抗體(、)100 ul 催素釋放激素(PRH)ELISA試劑盒IFN gamma γ-干擾素單克隆抗體100 ul |