PCR技術的定量原理: 擴增曲線 在Real- qPCR中,對整個PCR反應擴增過程進行了實時的檢測并記錄其熒光信號,隨著反應的進行,監(jiān)測到的熒光信號可以繪制成一條曲線,即為擴增曲線。熒光擴增曲線一般分為基線期、指數(shù)增長期和平臺期。 在Real-time qPCR擴增早期,擴增的熒光信號被熒光背景信號所掩蓋,無法判斷產(chǎn)物量的變化,此時即為基線期。 PCR反應過程中產(chǎn)生的DNA拷貝數(shù)是呈指數(shù)形式增加的,隨著反應循環(huán)數(shù)的增加,終PCR反應不再以指數(shù)形式生成模板,從而進入“平臺期”。在該時期,擴增產(chǎn)物已不再呈指數(shù)級的增加,PCR的終產(chǎn)物量與起始模板量之間無線性關系,所以根據(jù)終的PCR產(chǎn)物量不能計算出初始模板量。 熒光染料的優(yōu)點: 產(chǎn)品僅用于科研使用簡便; 可以與任何PCR產(chǎn)物結合; 價格便宜; 熒光染料的缺點: 不能區(qū)分不同的雙鏈DNA 引物二聚體會影響檢測的敏感性 非特異性產(chǎn)物會影響結果的敏感性 引物二聚體和非特異性擴增問題可以通過熔解曲線 (Melting curve) 進行識別,進而通過PCR引物的設計和反應條件的優(yōu)化得以解決??偟膩碚f,SYBR Green I方法是一種基礎也的Real-time qPCR實驗手段。 產(chǎn)品名稱 | 鯉皰疹病毒通用探針法熒光PCR檢測試劑盒 | 英文名稱 | Cyprinid Herpesvirus(CyHV) | 貨號 | YSP96606 |
? 熒光探針: Real-e qPCR中的熒光探針為TaqMan探針,其基本原理是依據(jù)目的基因設計合成一個能夠與之特異性雜交的探針,該探針的5'端標記熒光基團,3'端標記淬滅基團。 正常情況下兩個基團的空間距離很近,熒光基因因淬滅而不能發(fā)出熒光。PCR擴增時,引物與該探針同時結合到模板上,探針的結合位置位于上下游引物之間。 當擴增延伸到探針結合的位置時,Taq酶利用5'外切酶活性,將探針5'端連接的熒光分子從探針上切割下來,從而使其發(fā)出熒光。檢測到的熒光分子數(shù)與PCR產(chǎn)物的數(shù)量成正比,因此,根據(jù)PCR反應體系中的熒光強度即可計算出初始DNA模板的數(shù)量。 TaqMan探針技術解決了熒光染料與非特異性擴增結合的問題,反應結束后無需通過熔解曲線檢測,縮短了實驗時間。 TaqMan探針技術的優(yōu)點: 熒光背景低; 敏感性高; 雜交穩(wěn)定性高; 熒光光譜分辨率好; 特異性高。 TaqMan探針技術的缺點: 成本高; 設計難度大; 只能用于檢測產(chǎn)物長度低于150bp的反應。 由于TaqMan探針的高特異性,可用于等位基因的辨別,特別適用于人類基因多態(tài)性以及根據(jù)SNP區(qū)別和定量菌株。 ? 熒光定量PCR原理: 產(chǎn)品僅用于科研熒光定量PCR早稱TaqMan PCR,后來也叫Real-Time PCR,是美國PE(Perkin Elmer)公司1995年研制出來的一種新的核酸定量技術。該技術是在常規(guī)PCR基礎上加入熒光標記探針或相應的熒光染料來實現(xiàn)其定量功能的。其原理:隨著PCR反應的進行,PCR反應產(chǎn)物不斷累計,熒光信號強度也等比例增加。每經(jīng)過一個循環(huán),收集一個熒光強度信號,這樣我們就可以通過熒光強度變化監(jiān)測產(chǎn)物量的變化,從而得到一條熒光擴增曲線圖。 一般而言,熒光擴增曲線可以分成三個階段:熒光背景信號階段,熒光信號指數(shù)擴增階段和平臺期。在熒光背景信號階段,擴增的熒光信號被熒光背景信號所掩蓋,無法判斷產(chǎn)物量的變化。而在平臺期,擴增產(chǎn)物已不再呈指數(shù)級的增加,PCR 的終產(chǎn)物量與起始模板量之間沒有線性關系,根據(jù)終的 PCR 產(chǎn)物量也不能計算出起始 DNA 拷貝數(shù)。只有在熒光信號指數(shù)擴增階段, PCR產(chǎn)物量的對數(shù)值與起始模板量之間存在線性關系,我們可以選擇在這個階段進行定量分析。為了定量和比較的方便,在實時熒光定量 PCR 技術中引入了兩個非常重要的概念:熒光閾值和 CT值。 特別提示:本公司的所有產(chǎn)品僅可用于科研實驗,嚴禁用于臨床醫(yī)療及其他非科研用途! 二甲基二硫代氨酸鋅(>95.0%(T))GSTP1 (3F2) Mouse mAb異噻唑啉酮 并紅紫4B[pH指示劑]Phospho-Tyrosine Hydroxylase (Ser31) Antibody5-溴-2,二氟甲 間甲酚紫鈉鹽[pH指示劑]Phospho-Erk5 (Thr218/Tyr220) Antibody硝基芐鹽酸鹽 五甲氧基紅(>98.0%(HPLC))Phospho-Erk5 (Thr218/Tyr220) Antibody溴芐鹽酸鹽 甲基橙(>95.0%(W))Erk5 Antibody6-氯-1-羥基并三氮唑 溴氯酚藍[pH指示劑]Cathepsin B (G60) Antibody6-溴煙酸甲酯 乙基橙[pH指示劑]TrkC (C44H5) Rabbit mAb6-甲氧基煙酸甲酯 乙氧基橘紅鹽酸鹽(>95.0%(T))SimpleChIP® Human HUWE1 Intron 26 Control Primers三環(huán)己基膦 2,5-二酚(加約20%水濕潤,本品干重約為5g)(>99.0%(T))Phospho-Histone H3 (Ser10) (D2C8) XP® Rabbit mAb2-甲 間二酚藍[pH指示劑]Phospho-Histone H3 (Ser10) (D2C8) XP® Rabbit mAb乙酸薄荷酯 2-酚鈉鹽(>99.0%(HPLC)(T))PCAF (C14G9) Rabbit mAbalpha-溴-甲氧基乙酮 甲酚紅鈉鹽[pH指示劑]PCAF (C14G9) Rabbit mAb2-疏基吡啶 雙(2,二)乙酸乙酯(>98.0%(HPLC))PRMT4/CARM1 (C31G9) Rabbit mAb4,4'-偶氮雙(基戊酸) (1R,2R)-2-(萘-2,二甲酰亞基)環(huán)己甲酸(>98.0%(HPLC)(T))Phospho-NMDA Receptor 1 (GluN1) (Ser890) AntibodyH-ORN(CBZ)-OH (1S,2S)-2-(萘-2,二甲酰亞基)環(huán)己甲酸(>98.0%(HPLC)(T))NHERF1 (A140) Antibody2,5-二氟甲 (1S,2S)-2-(蒽-2,二甲酰亞基)環(huán)己甲酸(>97.0%(HPLC)) Cathepsin B (H190) Antibody (Mouse Preferred)甲基環(huán)戊二二聚體 Nα-(5-氟-2,二基)-L-亮氨酰(>98.0%(HPLC))Phospho-NMDA Receptor 1 (GluN1) (Ser896) AntibodyN-芐氧羰基-L-谷氨酰 Nα-(2,二硝基-5-氟基)-D-亮氨酰銨(>98.0%(HPLC))Phospho-NMDA Receptor 1 (GluN1) (Ser897) Antibody硝基吡唑 鯉皰疹病毒通用探針法熒光PCR檢測試劑盒性成纖維細胞生長因子6(bFGF-6)ELISA試劑盒Parvalbumin 細小清蛋白抗體20 ul 性成纖維細胞生長因子4(bFGF-4)ELISA試劑盒PTTG 垂體腫瘤轉化基因抗體1Kit 性成纖維生長因子(bFGF)ELISA試劑盒Peptide YY/PYY 酪酪肽抗體100 ul 甲狀腺素抗體(TAb)ELISA試劑盒Rad17 細胞周期檢控Rad17蛋白抗體100 ul 甲狀腺素(T4)ELISA試劑盒Phospho-Rad17 (Ser645) 酸化細胞周期檢控Rad17蛋白抗體100 ul 甲狀腺球蛋白IgG抗體ELISA試劑盒Rad51 Rad51抗體20 ul 甲狀腺球蛋白(TG)ELISA試劑盒Rad52 Rad52抗體100 ul 甲狀腺過氧化物酶(TPO)IgG抗體ELISA試劑盒RAD51C 癌和卵巢癌易感基因RAD51C抗體100 ul 甲狀腺過氧化物酶(TPO)ELISA試劑盒RAP1A 抗Rap1A抗體100 ul |